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透析法制备羟基喜树碱双嵌段共聚物纳米粒
公布工夫:2016-12-19

择要

 

  羟基喜树碱( hydroxy camptothecin,HCPT) 是从中国特有的珙桐科动物喜树中别离出的一种吲哚类生物碱,它能经过克制拓扑异构酶Ⅰ而发扬抗肿瘤成效,为广谱抗肿瘤药物。临床上次要剂型为注射用水针剂的开环羧酸盐 HCPT,因其临床疗效低、半衰期短等缺陷限定了该制剂的易发娱乐真人使用[1].以是开辟新型的 HCPT 制剂具有紧张的临床意义。
  
  甲氧基封真个聚乙二醇[methoxyl poly( ethyleneglycol) ,MePEG]是一种性子优秀的生物资料,具有生物相容性好,无毒,亲水性好,可以避免资料外表生物净化,增加卵白质吸赞同细菌黏附,并且不易被免疫体系辨认等长处[2].聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly ( lactic-co-glycolic acid) ,PLGA]由 两 种 单体---乳酸和羟基乙酸随机聚合而成,是一种可降解的功用高分子无机化合物,具有精良的生物相容性、无毒、精良的成囊和成膜的功能,经 FDA 同意可用作注射用微胶囊、微球及埋植剂等缓释制剂的辅料和内牢固安装,在生物医学范畴有着普遍的易发娱乐真人使用[3].有研讨标明,PLGA 作为资料制备成纳米粒可体现出较高的细胞及构造摄取率和较强的体内长循环特性[4].MePEG-PLGA 是这两者聚合而成的双嵌段聚合物,由于参加了亲水性强的 MePEG 分子,使 MePEG-PLGA 成为一端亲水另一端疏水的两性分子,可以延伸所载药物在体循环中的滞留工夫,且由于其粒径较小[5],可以作为较抱负的两亲性长循环载药纳米制剂的载体。
  
  双嵌段共聚物纳米粒的制备办法有多种,此中透析法操纵复杂,无机溶剂用量小,可以防止运用外表活性剂,成球性好,产率高而广受易发娱乐真人使用[5].本研讨以两亲性嵌段聚合物 MePEG-PLGA 为载体,羟基喜树碱( HCPT) 为模子药物,以一种自制改进的透析法制备羟基喜树碱双嵌段共聚物纳米粒( MePEG-PLGA-HCPT) 并对其功能表征、体外释药等方面停止调查评价。
  
  仪器与试药
  
  2996 2695 高效液相色谱仪 ( 美国 Waters 公司) ; 粉末-X'pert PRO X 射线衍射仪( 荷兰 PANalyti-cal 公司) ; DSC 204 差示扫描量热仪( 德国 Netzsch公司) ; DU800 紫外分光光度计( 美国 Beckman 公司) ; FV 1000 激光共聚焦显微镜( 日本 Olympus公司) ; JEM 2100 透射电子显微镜( 日本 JEOL 公司) ; Nano zs 激光粒度 Zeta 电位剖析仪( 美国Malvern 公司) ; LEO 1530 场发射扫描电子显微镜( 德国 LEO 公司) ; HZP 150 恒温振荡培育箱( 上海精宏实行设置装备摆设无限公司) .
  
  HCPT( 纯度 ≥99% ,湖北李时珍医药团体,批号: 20140108) ; MePEG-PLGA( PEG: 5000D,济南岱罡生物科技无限公司) ; 透析袋( MWCO 3 500 ~ 14000,北京经科宏达生物无限公司) ; N,N-二甲基甲酰胺( DMF,国药团体化学试剂无限公司) ; N,N-二甲基乙酰胺( DMAC,广东省汕头市西陇化工场) ; 醋酸铵( 剖析纯,国药团体化学试剂无限公司) ; 二甲基亚砜( DMSO,广东省汕头市西陇化工场) ; 其他试剂均为剖析纯。
  
  方 法
  
  1 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的制备
  
  接纳改进的透析法,准确称取肯定量 MePEG-PLGA 溶于过量无机溶剂中,室温搅拌使其完全溶解,得溶液 A; 准确称取肯定量 HCPT 溶于 0. 1 mol·L- 1的 NaOH 水溶液中,得溶液 B; 将溶液 B 逐滴参加搅拌的溶液 A 中,得混淆溶液 C; 将溶液 C 敏捷转移至透析袋,将透析袋密封后,置于含有稀盐酸的水情况中透析。过 1 h 后将透析袋置于活动的超纯水下透析,经 10 h 透析工夫后将透析袋中混悬液用1 μm 超滤膜过滤,离心,取沉淀冷冻枯燥即得纳米粒。空缺纳米粒子按上述办法间接将溶液 A 停止透析而得。本实行以粒径和载药量为评价规范,辨别调查差别溶剂、透析袋扣留绝对分子质量、透析温度、透析初始含水量、透析外水相 pH、聚合物浓度、载体中的聚乙二醇( PEG) 含量、载体中的乳酸( LA)含量以及 HCPT 与 MePEG-PLGA 投料质量比对其目标的影响,确定优化条件。
  
  2 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的质量评价
  
  2. 1 形状察看、粒径及 Zeta 电位的测定
  
  将 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒疏散于过量的去离子水中,然后将混悬液滴在洁净的硅片上,室温下天然枯燥,真空条件下喷金 20 s,制得扫描电镜( SEM) 样品; 将混悬液滴在300 目标铜网上,室温下天然枯燥后制得透射电镜( TEM) 样品。将 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒疏散在去离子水中,得当超声后将其置于检测皿中停止静态光散射剖析,停止粒度剖析及 Zeta 电位测定。每个样品反复测试 3 次。
  
  2. 2 高效液相色谱法( HPLC) 测定 HCPT
  
  2. 2. 1 色谱条件
  
  剖析柱为 RP-C18( Symmetry,250 mm × 4. 6 mm,5 μm) ; C18预柱( 10 mm ×4.6 mm,5 μm) ; 活动相为 0. 075 mol·L- 1醋酸铵( 冰醋酸调 pH至6.4) -乙腈( 72∶ 28) ; 进样量为 50 μL; 流速为 0. 8mL·min- 1; 紫外检测波长为 380 nm; 温度为30 ℃。
  
  2. 2. 2 样品的制备 准确称取 HCPT 规范品 10 mg,置于 100 mL 棕色量瓶中,加 DMSO 浓缩并定容,配制成浓度为 100 μg·L- 1的样品溶液。
  
  2. 2. 3 规范曲线 取上述样品溶液加色谱甲醇浓缩为 100 μg·mL- 1的母液。将母液用过量 pH 3 的0. 01 mol·L- 1柠檬酸浓缩失掉 50,200,500,1 000,1 500,2 000,3 000 ng·mL- 1的系列浓度内酯环 HCPT规范溶液; 异样,母液用过量 pH 9 的 0. 01 mol·L- 1硼酸-色谱乙腈( 50∶ 50) 混淆液浓缩失掉上述异样系列浓度的羧酸盐 HCPT 规范溶液。在上述色谱条件下进样,以峰面积( Y) 为纵坐标,HCPT 浓度( X) 为横坐标停止线性回归。
  
  2. 3 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒载药率及包封率的测定
  
  准确称取 100 mg 纳米粒粉末,依 HPLC 法停止HCPT 含量测定。按下列公式盘算:
  
  载药量/% = ( 载药微粒中 HCPT 的质量/载药微粒的质量) ×100包封率/% = ( 实践载药量/实际载药量) ×1002. 4 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒中 HCPT 的形态
  
  2. 4. 1 X-射线衍射仪剖析 ( XRD) 辨别将 Me-PEG-PLGA-HCPT 纳米粒、HCPT、空缺 MePEG-PLGA纳米粒及 HCPT 和空缺 MePEG-PLGA 纳米粒物理混淆物( 混淆物的摩尔比依照载药纳米粒的载药量相应盘算) 做 X 射线衍射剖析。电流: 30 mA; 电压:40 kV; 扫描范畴: 2θ = 5 ~ 60°; 扫描步长: 每步 0.016°; 每步工夫: 10 s; 靶: 铜靶; 单色器: 石墨单色器。
  
  2. 4. 2 差示扫描量热仪剖析( DSC) 同上,取样品5 ~ 10 mg 置于铝盘内并密封,升温速率 10 ℃·min- 1,于氮气( 40 mL·min- 1) 维护下测定样品的热功能,调查 HCPT 在纳米粒中的物理形态。
  
  2. 4. 3 激光共聚焦显微镜调查( CLSM) 将透析
  
  后的混悬液滴加在洁净的载玻片上并盖上盖玻片,天然枯燥后用无色指甲油封片制得激光共聚焦显微镜样品。HCPT 荧光由 382 nm 的氩激光激起,样品的荧光散布由 z 轴的偏向从纳米颗粒的最顶部往最底层察看,每层之间相隔 60 nm.
  
  3 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的体外释药准确称取 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒粉末并装入透析袋内( 扣留绝对分子质量 3 500) ,参加大批0. 1 mol·L- 1PBS( pH 6. 8,7. 4,8. 0) ,扎紧后将其置于 100 mL PBS 缓冲液中,在( 37 ± 0. 5) ℃,100 r·min- 1条件下恒温振荡,定时取样,并立刻补加相反量的释药介质。样品用 0. 2 μm 微孔滤膜过滤后用HPLC 法测定 HCPT 的浓度,盘算累积开释量。
  
  结 果
  
  1 优化制备条件
  
  实行确定终极优化条件为: 接纳丙酮作为溶剂,透析袋扣留绝对分子质量为 14 000 D,透析温度为25 ℃ ,透析初始含水量 1% ,透析外水相 pH 4. 0,聚合物浓度为 3 mg·mL- 1,载体中的 PEG 含量 15%,载体中的 LA 含量为 100%,HCPT 与 MePEG-PLGA投料质量比为 1∶ 5.
  
  2 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的质量评价
  
  2. 1 扫描电镜和透射电镜剖析
  
  图 1 为优化制备的 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的扫描电镜照片,从图 1 可以看出,粒子为球形构造,外表光滑油滑,粒径散布均一,粒径小于 200 nm,成球率高。接纳透射电镜察看 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒的构造,其后果如图 2 所示,发明 TEM 与 SEM后果根本符合。载药纳米粒为实心球形构造,壳核构造分明,外表光滑油滑,粒径散布均一。
  
  2. 2 HCPT 测定办法学调查
  
  由于 HCPT 受 pH 值影响存在内酯环和羧酸盐,即闭环和开环两种方式,因而有须要对这两种方式辨别停止调查。在实行中辨别绘制内酯环和羧酸盐 HCPT 两条规范曲线,便于对二者体外释药的辨别定量。在色谱条件下,两种方式的 HCPT 完全别离,内酯环 HCPT 的保存工夫为 6. 5 min,羧酸盐HCPT 的保存工夫为 2. 9 min; 内酯环 HCPT 规范曲线回归方程为: Y =294.62X -4 721.5( R2= 0. 997 9) ;羧酸盐 HCPT 回归方程 Y = 252. 85X + 9 555( R2=0. 997 9) .线性范畴为 50 ~ 3 000 ng·mL- 1.
  
  由于羟基喜树碱以羧酸盐构型存在时检测敏捷度较低,相反系列浓度呼应值很低。因而释药时期,隔时在每个样品组中辨别取两份 1 mL 溶出介质,此中一份用醋酸酸化,将 HCPT 全转化成内酯环构型,用来测定此时开释的 HCPT 总量; 另一份未用醋酸酸化,用来测定开释的 HCPT 中酯环构型的含量,两个差值即为 HCPT 中羧酸盐构型的含量。
  
  2. 3 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒理化性子表征依照粒径、Zate 电位、包封率和载药量的测定办法,优化制备的 MePEG-PLGA-HCPT-纳米粒均匀粒径为( 120. 1 ± 2. 4) nm; 多疏散系数为( 0. 057 ±0. 021) ; Zeta 电位为( - 31. 2 ± 0. 98) mV; 包封率为( 44. 5 ±0. 84) %,载药量为( 7. 42 ± 0. 23) %; 均为n = 3.
  
  2. 4 HCPT 在纳米粒中的形态
  
  2. 4. 1 XRD 剖析 HCPT、MePEG-PLGA 纳米粒、HCPT 与 MePEG-PLGA 物理混淆物、MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒停止 XRD 剖析,调查 HCPT 存在形态,后果见图 3.
  
  后果可见,HCPT 在 5° <2θ <35°范畴内出现很多强结晶衍射峰,标明 HCPT 次要以结晶型存在;MePEG-PLGA 在 2θ = 19. 206° 和 23. 422° 有 2 个特性峰; 而 MePEG-PLGA 与 HCPT 物理混淆物兼具两者的特性峰,并且没有其他重生成的峰,标明二者之间无互相作用发作,但是 HCPT 局部衍射峰曾经被MePEG-PLGA 所掩饰笼罩,且强度有所削弱,标明 HCPT的晶体性子可被 MePEG-PLGA 经过物理混淆的手腕局部掩饰笼罩; 在 MePEG-PLGA-HCPT-NPs 的衍射图谱中,体现出与 MePEG-PLGA/HCPT 物理混淆物特性类似的构造特性,HCPT 的晶体衍射峰局部消逝,标明在 MePEG-PLGA 纳米粒中,HCPT 与 MePEG-PLGA 处于一种高度疏散的形态,其本身的晶体特性被克制。以上后果阐明,HCPT 因此晶体方式存在于 MePEG-PLGA-HCPT-NPs 中,相似研磨后的物理混淆物。
  
  2. 4. 2 DSC 剖析 药物在基质中的散布形态可经过测 定 载 药 基 质 中 药 物 的 吸 收 峰 来 判 断。对HCPT、MePEG-PLGA 纳 米 粒、MePEG-PLGA-HCPT纳米粒停止差热扫描剖析。后果见图 4.
  
  HCPT 的谱图在 60 和 130 ℃ 有 2 个很锋利的吸热峰,空缺 MePEG-PLGA 纳米粒的谱图只要 1 个特性峰,此峰反应的是 MePEG-PLGA 的玻璃化变化进程中的吸热峰,而在 MePEG-PLGA-HCPT-NPs 的谱图中同时呈现了 HCPT 和空缺 MePEG-PLGA 纳米粒的吸热峰,但是 MePEG-PLGA 的吸热峰和 HPCT的 1 个吸热峰发作了前移景象,缘由能够是 HCPT和 MePEG-PLGA 在透析进程中二者互相缠绕在一同,低落了相互的吸热能量所致,而二者的性子没有发作基本变革。
  
  2. 4. 3 HCPT 在纳米粒中的散布( CLSM) 为了察看 HCPT 在 MePEG-PLGA 纳米粒内的散布,接纳激光共聚焦显微镜对 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒停止扫描,见图 5.由于 MePEG-PLGA 没有荧光,以是图中绿色局部代表 HCPT.验证了 HCPT 平均疏散在MePEG-PLGA 纳米粒中,为基体式缓释体系。同时,这些图片从另一角度证明白载药纳米颗粒的壳核球体构造。
  
  3 体外释药举动调查
  
  图 6 为 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒在 pH 6. 8,7. 4,8. 0 的条件下,30 d 内体外释药曲线,其 HCPT累积释药量辨别为 53. 3%,63. 1%,83. 3%.可见MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒具有肯定的缓释作用,能明显延伸 HCPT 的开释,长效作用愈加分明。在pH 8. 0 条件下,HCPT 以内酯环方式、羧酸盐方式配合存在( 见图 7) ,此中羧酸盐方式 HCPT 累积释药量为 72%,内酯环方式 HCPT 累积释药量坚持为11% 左右。
  
  讨 论
  
  通常,内酯环方式的 HCPT 不溶于水,微溶于无机溶剂,这一特点使得药物难以载入到聚合物载体中。而羧酸盐方式的 HCPT 具有水溶性特性,并可以经过与 NaOH 调理 pH 失掉。但是这种羧酸盐方式的 HCPT 体现为极低的抗拓扑异构酶 I 活性,以是本研讨中我们思索应用透析外水相的酸性情况来使载入到聚合物中的羧酸盐方式的 HCPT 重新变化成高药效的内酯环方式。然后,应用去离子水透析,撤除多余的酸碱盐。本办法充沛运用透析法的特点应用 HCPT 的溶解性、药效性的 pH 可控特点,较好地制备出载羟基喜树碱双嵌段共聚物纳米粒。
  
  由于包封率对液体制剂才有较高的意义,关于冻干制剂,载药量是最为紧张的。而本研讨为冻干制剂。以是,固然所失掉的载药纳米粒包封率并不高,仅 44. 5%,但 却 有 着 较 高 的 载 药 量,高 达7. 42% ,具有紧张的易发娱乐真人使用代价,与已研讨的 HCPT 纳米制剂相比有着分明的高载药量劣势[7 -8].
  
  MePEG-PLGA-HCPT 纳 米粒在 3 个 pH 值的PBS 释药举动中,出现双相开释特性,前半局部的突释次要由于吸附在纳米粒子外表药物的分散,然后局部的缓释次要是包裹在纳米粒中药物的开释。别的,随着开释介质 pH 值的上升,药物开释速率上升,这是由于 HCPT 在碱性条件下易由内酯环方式变化为水溶性羧酸盐方式的 HCPT,更易开释到缓冲溶液中的缘故。
  
  MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒在 30 d 的体外开释实验中释药较慢,其释药量不克不及到达 100%,能够是由于 MePEG-PLGA 的降解速率很慢,以是另有局部药物残留在纳米粒中; 别的,大局部药物以晶体方式疏散在聚合物中,其不溶于水或微溶于中性的透析液中,也延缓了药物的开释。这也进一步标明了本法制备的载药粒子具有较好的缓释结果。体外释药曲线仅表现该纳米粒具有较长的缓释结果,而经过其体内释药状况来评价抗肿瘤作用,另有待于进一步研讨。估计在体内时有种种酶的存在和肿瘤构造中的情况能够会减速 HCPT 开释。
  
  本研讨乐成制备了高载药量、具有肯定缓释成效的长循环双嵌段共聚物 MePEG-PLGA-HCPT 纳米粒,为 HCPT 提供了一种新的缓释剂型。后续的研讨将进一步探究细胞生物学效应、药效学等研讨,为将来的开辟易发娱乐真人使用提供实际根据。
  
  [ 参 考 文 献 ]
  
  [1] LIU K,DING X,DENG B,et al. 10-Hydroxycamptothecin pro-duced by a new endophytic Xylaria sp. ,M20,from Camptothecaacuminata[J]. Biotechnol Lett,2010,32( 5) : 689 - 693.
  
  [2] PASUT G,VERONESE FM. PEG conjugates in clinical develop-ment or use as anticancer agents: an overview[J]. Adv Drug DelivRev,2009,61( 13) : 1177 - 1188.
  
  [3] ANAND P,NAIR HB,SUNG B,et al. Design of curcumin-loadedPLGA nanoparticles formulation with enhanced cellular uptake,andincreased bioactivity in vitro and superior bioavailability in vivo[J]. Biochem Pharmacol,2010,79( 3) : 330 -338.
  
  [4] 杨方,张硕,郑思想,等。 无波动剂修饰的汉防己甲素 PLGA 纳米粒制备及体外评价[J]. 中国医院药学杂志,2015,35( 15) :1375 - 1380.
  
  [5] 何礼,韩瑞伟,唐晓飞,等。 染料木素 MePEG-PLGA 共聚物胶束的制备及其药动学研讨[J]. 中国古代易发娱乐真人使用药学,2012,29( 6) : 477 -482.
  
  [6] YANG XQ,CHEN YH,YUAN RX,et al. Folate-encoded andFe3O4-loaded polymeric micelles for dual targeting of cancer cells[J]. Polymer,2008,49( 16) : 3478.
  
  [7] YANG L,CUI F,CUN D,et al. Preparation,characterization andbiodistribution of the lactone form of 10-hydroxycamptothecin( HCPT) -loaded bovine serum albumin( BSA) nanoparticles[J].Int J Pharm,2007,340( 1 - 2) : 163 - 172.
  
  [8] 张秀娟,柯丽明,杨菁,等。 载羟基喜树碱聚乳酸-羟基乙酸微球的制备及相干功能研讨[J]. 生物医学工程与临床,2012,16( 2) : 114 -117.

 

 

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